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Specific highly fluorescent FRET substrate for the determination of caspase-1 (ICE) and caspase-1-like enzyme activities. Cleavage of Mca-YVADAPK(Dnp) at the P1 Asp residue results in a continuous fluorescent assay monitored at an emission wavelength of 392 nm. Caspase-3 (apopain, CPP-32) is only weakly active on this substrate. Both caspase-1 and caspase-3 are involved in apoptosis. A specific substrate for renal ACE 2.

多肽MCA-Tyr-Val-Ala-Asp-Ala-Pro-Lys(Dnp)-COOH的合成步驟：

1、合成CTC樹脂：稱取1.17g CTC Resin（如初始取代度約為1.17mmol/g）和1.64mmol Fmoc-Lys(Dnp)-OH于反應(yīng)器中，加入適量DCM溶解氨基酸（需要注意，此時CTC樹脂體積會增大好幾倍，避免DCM溶液過少），再加入4.11mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反應(yīng)2-3小時后，可不抽濾溶液，直接加入1ml的HPLC級甲醇，封端半小時。依次用DMF洗滌2次，甲醇洗滌1次，DCM洗滌一次，甲醇洗滌一次，DCM洗滌一次，DMF洗滌2次（這里使用甲醇和DCM交替洗滌，是為了更好地去除其他溶質(zhì)，有利于后續(xù)反應(yīng)）。得到  Fmoc-Lys(Dnp)-CTC Resin。結(jié)構(gòu)圖如下：

2、脫Fmoc：加3倍樹脂體積的20%Pip/DMF溶液，鼓氮氣30分鐘，然后2倍樹脂體積的DMF 洗滌5次。得到 H2N-Lys(Dnp)-CTC Resin 。（此步驟脫除Fmoc基團(tuán)，茚三酮檢測為藍(lán)色，Pip為哌啶）。結(jié)構(gòu)圖如下：

3、縮合：取4.11mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述樹脂里，加適當(dāng)DMF溶解氨基酸，再依次加入8.21mmol DIPEA，3.9mmol HBTU。反應(yīng)30分鐘后，取小樣洗滌，茚三酮檢測為無色。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂。（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。得到Fmoc-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：樹脂=3：6：2.85：1（摩爾比）。結(jié)構(gòu)圖如下：

4、依次循環(huán)步驟二、步驟三，依次得到

H2N-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

H2N-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin

以上中間結(jié)構(gòu)，均可在專肽生物多肽計算器-多肽結(jié)構(gòu)計算器中，一鍵畫出。

最后再經(jīng)過步驟二得到 H2N-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTC Resin，結(jié)構(gòu)如下：

5、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)反應(yīng)連接：在上述樹脂中，加入適當(dāng)DMF后，再加入4.11mmol 7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)到樹脂中，再加入8.21mmol DIPEA、3.9mmol HBTU，鼓氮氣反應(yīng)30分鐘。用2倍樹脂體積的DMF 洗滌3次樹脂（洗滌樹脂，去掉殘留溶劑，為下一步反應(yīng)做準(zhǔn)備）。 得到MCA-Tyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Pro-Lys(Dnp)-CTCResin。 結(jié)構(gòu)如下：

6、切割：6倍樹脂體積的切割液（或每1g樹脂加8ml左右的切割液），搖床搖晃 2小時，過濾掉樹脂，用冰無水乙醚沉淀濾液，并用冰無水乙醚洗滌沉淀物3次，最后將沉淀物放真空干燥釜中，常溫干燥24小試，得到粗品MCA-Tyr-Val-Ala-Asp-Ala-Pro-Lys(Dnp)-COOH。結(jié)構(gòu)圖見產(chǎn)品結(jié)構(gòu)圖。

切割液選擇：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前兩種適合沒有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三種適合幾乎所有的序列。）

6、純化凍干：使用液相色譜純化，收集目標(biāo)峰液體，進(jìn)行凍干，獲得蓬松的粉末狀固體多肽。不過這時要取小樣復(fù)測下純度 是否目標(biāo)純度。

7、最后總結(jié)：

杭州專肽生物技術(shù)有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主營定制多肽合成業(yè)務(wù)，提供各類長肽，短肽，環(huán)肽，提供各類修飾肽，如：熒光標(biāo)記修飾（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基團(tuán)修飾肽（疊氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素標(biāo)記肽（N15、C13），訂書肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修飾肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修飾肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），環(huán)肽（酰胺鍵環(huán)肽、一對或者多對二硫鍵環(huán)），生物素標(biāo)記肽，PEG修飾肽，甲基化修飾肽

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