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二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經(jīng)氧化形成。
 

形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。
 

二硫鍵的合成過程，  可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應(yīng)進程進行監(jiān)測。  
   

如果多肽中只含有1對Cys，那二硫鍵的形成是簡單的。多肽經(jīng)固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中進行氧化。      
 

當(dāng)需要形成2對或2對以上的二硫鍵時，合成過程則相對復(fù)雜。盡管二硫鍵的形成通常是在合成方案的最后階段完成，但有時引入預(yù)先形成的二硫化物是有利于連合或延長肽鏈的。通常采用的巰基保護基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。我們分別列出兩種以2-Cl樹脂和Rink樹脂為載體合成的多肽上多對二硫鍵形成路線：
 

二硫鍵反應(yīng)條件選擇    
 

 二硫鍵即為蛋白質(zhì)或多肽分子中兩個不同位點Cys的巰基（-SH）被氧化形成的S-S共價鍵。 一條肽鏈上不同位置的氨基酸之間形成的二硫鍵，可以將肽鏈折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)。多肽分 子通常分子量較大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)中形成二硫鍵時要求兩個半胱氨酸在空間距離上接近。 此外，多肽結(jié)構(gòu)中還原態(tài)的巰基化學(xué)性質(zhì)活潑，容易發(fā)生其他的副反應(yīng)，而且肽鏈上其他側(cè)鏈 也可能會發(fā)生一系列修飾，因此，肽鏈進行修飾所選取的氧化劑和氧化條件是反應(yīng)的關(guān)鍵因素， 反應(yīng)機理也比較復(fù)雜，既可能是自由基反應(yīng)，也可能是離子反應(yīng)。      

反應(yīng)條件有多種選擇，比如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過程，也可以采用H2O2，I2， 汞鹽等激烈的反應(yīng)條件。
 

空氣氧化法： 空氣氧化法形成二硫鍵是多肽合成中最經(jīng)典的方法，通常是將巰基處于還原態(tài)的多肽溶于水中，在近中性或弱堿性條件下（PH值6.5-10），反應(yīng)24小時以上。為了降低分子之間二硫鍵形成的可能，該方法通常需要在低濃度條件下進行。
 

碘氧化法：將多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘進行氧化，反應(yīng)15-40min。當(dāng)肽鏈中含有對碘比較敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時，氧化條件要控制的更精確，氧化完后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉除去過量的碘。 當(dāng)序列中有兩對或多對二硫鍵需要成環(huán)時，通常有兩種情況：
 

自然隨機成環(huán):       序列中的Cys之間隨機成環(huán)，與一對二硫鍵成環(huán)條件相似；
 

定點成環(huán)：       定點成環(huán)即序列中的Cys按照設(shè)計要求形成二硫鍵，反應(yīng)過程相對復(fù)雜。在 固相合成多肽之前，需要提前設(shè)計幾對二硫鍵形成的順序和方法路線，選擇不同的側(cè)鏈 巰基保護基，利用其性質(zhì)差異，分步氧化形成兩對或多對二硫鍵。       通常采用的巰基保護 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多種基團。

多肽熒光標記由于沒有放射性，實驗操作簡單。因此，目前在生物學(xué)研究中多肽熒光標記應(yīng)用非常廣泛，多肽熒光標記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對于有游離羧基的采用的方法與接多肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接。 在N端標記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的多肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免在切割的過程中被TFA切割掉。
        人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將 其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        專肽生物能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標記多肽。
 

下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：




FITC標記
 

      FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標記于多肽 上：(1) 將FITC標記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基 上；(2) 將FITC標記于多肽N端氨基。

      當(dāng)在N端標記時，建議在最后一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入 烷基間隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標記FITC 的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會伴有最后一個氨基酸的去除，但當(dāng)有一個間隔器 如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。空間位阻 被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標記的多肽上。

普通熒光修飾

通過Lys側(cè)鏈氨基連接的熒光修飾

專肽常做的熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長?？晒﹨⒖歼x擇：